Fluo-8, AM是最常用的檢測細胞內(nèi)鈣離子濃度的熒光探針之一。它穿透細胞膜進入細胞后被細胞內(nèi)的酯酶剪切形成Fluo-8，從而被滯留在細胞內(nèi)，F(xiàn)luo-8若以游離配體形式存在時幾乎是非熒光性的，但是當它與細胞內(nèi)鈣離子結(jié)合后可以產(chǎn)生較強的熒光，最大激發(fā)波長為490nm，最大發(fā)射波長為514nm。可以使用激光共聚焦顯微鏡或流式細胞儀檢測細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。

操作說明（for Human T cells）*

（1） 試劑

2 mM的Fluo-8, AM/DMSO（將1mg Fluo-8, AM溶于442μL DMSO）

Pluronic F127

Hanks•balanced salt solution（HBSS）

HEPES buffer saline（10mM HEPES，1mM Na2HPO4，137mM NaCl，5mM KCl，1mM CaCl2，0.5mM MgCl2，5mM glucose，0.1% BSA，pH 7.4）

（2） 操作

①. 向Fluo-8, AM/DMSO溶液中加入16.5mg Pluronic F127，Pluronic F127可以防止Fluo-8, AM在HBSS中聚合并能幫助其進入細胞。

②. 用HBSS稀釋Fluo-8, AM溶液，制備4μM的Fluo-8, AM工作液。

③. 將Fluo-8, AM工作液加入細胞，在37℃培養(yǎng)20分鐘。

④. 加入5倍體積的含有1%胎牛血清的HBSS，再繼續(xù)培養(yǎng)40分鐘。

⑤. 用HEPES buffer saline洗滌細胞3次，然后用HEPES buffer saline使細胞重懸浮，制成1×105 cells/mL的溶液。

⑥. 37℃下培養(yǎng)10分鐘，然后用該細胞進行熒光鈣離子檢測。激發(fā)波長490nm，發(fā)射波長514nm。

*標記的條件因細胞種類而異，在每次實驗前，請先確定最佳條件。以上方法僅供參考。

儲存條件：-20℃干燥避光保存，有效期一年。