Western Blot實驗中經(jīng)常提到的一個名稱——內(nèi)參。內(nèi)參即內(nèi)部參照，一般是指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白，它們在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對恒定，在檢測蛋白的表達(dá)水平變化時常用它來做參照物。
內(nèi)參的作用很多，其可以確保所有樣本的上樣量一致，可以作為校正蛋白樣品定量以及上樣過程中的誤差，保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，也可以作為空白對照，檢測WB過程中蛋白轉(zhuǎn)膜是否完全以及發(fā)光顯色體系是否正常。
那么在內(nèi)參的選擇上面我們應(yīng)該注意什么呢？
(1) 根據(jù)不同的種屬，比如哺乳動物通常選擇β-actin、β-tubulin、GAPDH；植物來源實驗樣本，則可以選擇Plant actin、Rubisco等。
(2) 根據(jù)蛋白大小選擇，一般要選擇目的蛋白與內(nèi)參分子量相差至少5kD以上，才便于對結(jié)果分析。且當(dāng)研究的蛋白的分子量與內(nèi)參接近時，需要選擇分子量與目的蛋白的分子量差距比較大的蛋白。常用內(nèi)參蛋白的分子量大小見表1。
(3) 根據(jù)研究靶蛋白的定位選擇內(nèi)參，比如核蛋白內(nèi)參可以選擇Lamin B、Histone H3等。小編已經(jīng)將不同來源的蛋白對應(yīng)常用的內(nèi)參蛋白信息匯總?cè)缦卤恚?/p>
表1. 不同來源的蛋白對應(yīng)的常用的內(nèi)參蛋白
| 樣本類型 | 常用的內(nèi)參蛋白 | 分子量大小(kDa) |
| 全細(xì)胞蛋白 | β-actin | 43 |
| β-tubulin | 55 | |
| Cyclophilin A | 55 | |
| GAPDH | 37 | |
| α-actin | 43 | |
| α-tubulin | 55 | |
| Cyclophilin A | 18 | |
| Vinculin | 116 | |
| 線粒體蛋白 | Hsp60 | 60 |
| VDCA1/porin | 31 | |
| 核蛋白 | Histone H1/H3 | |
| Lamin B1 | 66 | |
| PCNA | 29 | |
| TATA binding protein TBP | 38 | |
| HDAC1 | 55 | |
| 細(xì)胞骨架 | β-actin | 43 |
| β-tubulin | 55 | |
| α-actin | 43 | |
| α-tubulin | 55 | |
| Cofilin | 20 | |
| 血清蛋白 | Transferrin | 77 |
(4)根據(jù)實驗的具體條件選擇，有些實驗條件會對管家基因的表達(dá)有影響而導(dǎo)致部分管家基因不適合做改條件下的內(nèi)參基因，比如于組織缺氧、糖尿病等因素會導(dǎo)致GAPDH的表達(dá)增高，不適合做內(nèi)參，凋亡實驗時，Lamin等也不適合作為內(nèi)參。
(5)根據(jù)樣本類型選擇內(nèi)參，比如做各種分泌液樣本的時候，如血漿、乳汁、組織液等，由于沒有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，只能選擇一些分泌蛋白作為內(nèi)參。
介紹完了內(nèi)參的選擇，下面我們來介紹下今天的主角GAPDH、β-actin和β-tubulin。這3個WB實驗中最常用內(nèi)參。
1. GAPDH抗體
【GAPDH】甘油醛-3-磷酸脫氫酶，是參與糖酵解的一種關(guān)鍵酶，催化糖酵解的第六步,它還參與核轉(zhuǎn)錄等事件,核糖核酸轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制和修復(fù)以及細(xì)胞凋亡。由4個30-40 kDa的亞基組成，分子量146kDa，檢測條帶大約在36kDa。GAPDH基因幾乎在所有組織中都高水平表達(dá)，廣泛用作WB的內(nèi)參。
2. β-Tubulin抗體
Tubulin即微管蛋白，是細(xì)胞的一種骨架蛋白。Tubulin分為α、β、γ、δ、ε等多種tubulin，其中α-Tubulin和β-Tubulin可以形成異源二聚體，是形成微管的最主要的兩種Tubulin。α-tubulin和β-tubulin分子量分別為55kDa和50kDa，其實際檢測條帶均在55kDa左右。作為內(nèi)參，β-tubulin的蛋白水平通常不會發(fā)生改變，因此被廣泛用于Western Blotting時上樣量是否一致的參照，α-Tubulin和β-Tubulin構(gòu)成微管蛋白的結(jié)構(gòu)也常被用于免疫染色觀察細(xì)胞的微管結(jié)構(gòu)。
3. β-Actin內(nèi)參抗體
Actin即肌動蛋白，是細(xì)胞的一種重要骨架蛋白。Actin大致可分為六種，其中四種是不同肌肉組織特異性的，其余兩種廣泛分布于各種組織中，包括 β-actin和γ-non-muscle actin。β-actin作為內(nèi)參是得到了公認(rèn)的，這是針對大多數(shù)組織和細(xì)胞來說的，它廣泛分布于細(xì)胞漿內(nèi)，表達(dá)量非常豐富，其含量占所有細(xì)胞總蛋白的50%。但是在一些少量特殊的情況下，如脂肪組織或細(xì)胞β-Actin抗體推薦—高效價的內(nèi)參抗體內(nèi)，β-Actin的表達(dá)量就很少。β-actin由375個氨基酸組成，分子量大小為42-43kDa左右。
以上三種內(nèi)參可以滿足80%以上的WB實驗需求，Abbkine推出的通用內(nèi)參抗體雞尾酒，是一種包含了免疫實驗(WB、IHC-P、IF)過程中常用的抗體β-Actin、GAPDH和β-Tubulin以及抗體稀釋液的套裝，并提供了陽性對照，是WB等實驗內(nèi)參的不二之選。
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